Protokół immunoprecypitacji metodą pull-down przy użyciu kulek z białkiem A lub białkiem G

Protokół immunoprecypitacji metodą pull-down przy użyciu kulek z białkiem A lub białkiem G.

Protokoły biochemii, biologii molekularnej i biologii komórkowej >> Protokół immunoprecypitacji metodą pull-down przy użyciu kulek z białkiem A lub białkiem G.

Bufor myjący
20mM Tris
0,2% Triton

Bufor do wymywania


wykonany w tym samym buforze co bufor do przemywania, ale zawiera również 4% SDS (w razie potrzeby zawiera również inhibitory proteazy)

1. Odwirować resztki w odpowiedniej ultrawirówce przy 100 000 x g przez 10 min. aby zapobiec zatykaniu podczas testu pull-down.
2. jeśli jest wystarczająca ilość próbki, pobierz trochę próbki, aby zbadać frakcję przedkolumnową.
3. inkubować odwirowany supernatant ze specyficznym przeciwciałem przeciwko białku będącego przedmiotem zainteresowania (1 godzina jest ogólnie dobra, noc może być OK, jeśli nie ma agregacji) w 4 stopniach C.
4. inkubować przez kolejną godzinę lub dłużej w 4 stopniach C połączoną próbkę w wystarczającej ilości kulek (zwykle sefarozy), które zostały kowalencyjnie skoniugowane z Białkiem A lub Białkiem G, które zwiążą pierwotne specyficzne przeciwciało.
5. krótko odwirować kulki w mikrowirówce i pobrać trochę próbki, aby rozpuścić niezwiązaną frakcję na żelu.
6. ponownie zawiesić kulki w pozostałym roztworze i umieścić w kolumnie wirującej (takiej jak Millipore, która ma filtry o odpowiedniej wielkości porów, które zapobiegają wirowaniu kulek na dno probówki).
7. wirować przez kilka sekund supernatant w mikrowirówce i usunąć ciecz wypływającą z dna przesączu.
8. umieścić kolumnę na lodzie.
9. dodać bufor do przemywania do kolumny.
10. wypłucz kolumnę jeszcze co najmniej 5-6 razy, powtarzając wirowanie i dodając nowy bufor do przemywania (niektórzy zachowują bufor do przemywania, aby przeanalizować, czy w tym kroku eluowało się jakiekolwiek białko).
11. (alternatywną metodą do tego typu płukania jest dodanie buforu do przemywania do kulek w probówce Eppendorf, odwrócenie w celu wymieszania, krótkie i delikatne wirowanie kulek, a następnie usunięcie buforu do przemywania).
12. przed dodaniem buforu do elucji, odwirować i usunąć bufor do przemywania.
13. jeśli używasz SDS w buforze do elucji, wytrząsaj w temperaturze pokojowej (~ 250 rpm) przez ~ 15 minut.
14. odwirować, zachować eluowany bufor (który zawiera twoją próbkę), dodać więcej buforu do elucji i wstrząsnąć przez kolejne 5 minut.
15. ponownie zakręć; w razie potrzeby można przeprowadzić dodatkowe potrząsanie.
16. Przeanalizuj różne frakcje uzyskane w teście pull-down metodą Western blot (pamiętaj, że jedno z twoich prążków będzie pochodziło z eluowanego przeciwciała monoklonalnego).
17. podczas procedury immunoprecypitacji należy uwzględnić kontrolę negatywną przy użyciu perełek sprzężonych z innym przeciwciałem, aby upewnić się, że białka poddane koimmunoprecypitacji rzeczywiście oddziałują ze sobą.

Leave a Reply

Your email address will not be published. Required fields are marked *