pGreen-S: wektor klonu bez wzmocnionego zielonego białka fluorescencyjnego do badań przesiewowych rekombinantów

Bakteryjny wektor do klonowania pGreen-S został skonstruowany przez wstawienie genu wzmocnionego zielonego białka fluorescencyjnego (EGFP) w miejscu restrykcyjnym Xbal plazmidu pUC18. Po ekspresji w Escherichia coli DH5alfa wytworzyły kolonie, które miały zielony kolor absyntu w świetle dziennym i silnie fluorescencyjną zieleń w świetle ultrafioletowym o długich falach.

Wektor pGreen-S zastosowano do selekcji wstawki kierunkowej w oparciu o utratę zielonej fluorescencji w zrekombinowanych koloniach, która była spowodowana brakiem EGFP. System reporterowy EGFP różni się od konwencjonalnego uzupełniania lacZ, czyniąc rekombinanty przesiewowe prostszymi, tańszymi i bardziej skutecznymi.

Oceniliśmy wpływ czterech różnych kombinacji genów wirulencji (vir) na wydajność transformacji roślin i zachowanie transgenu w ryżu przy użyciu podwójnego systemu wektorów binarnych pGreen/pSoup.

• Doświadczenia transformacji przeprowadzono przy użyciu wektora pGreen zawierającego jednostki ekspresji bar i gusA z lub bez genów virG542, virGN54D, virGwt lub virG/B/C dodanych do szkieletu.
• Dodatkowe geny vir znacząco zmieniły wydajność transformacji roślin i integrację sekwencji szkieletu wektora.
• Jednak nie można było wykryć żadnych różnic w liczbie kopii transgenu, odsetku linii wyrażających i poziomach ekspresji. Dodanie virGwt było najbardziej korzystne, podwajając ogólną wydajność systemu wektorów pGreen/pSoup w oparciu o częstotliwość transformacji, brak integracji sekwencji szkieletowej i ekspresję niewyselekcjonowanych transgenów.
• W 39% linii roślin dodatkowe geny vir zostały zintegrowane z genomem ryżu. Omówiono wkład wektorów „super dual-binarnych” pGreen/pSoup w rozwój wydajnych systemów transformacji ryżu oraz w produkcję roślin wolnych od genów markerów selekcyjnych.
• Integrację transgenu, poziom ekspresji i stabilność badano w ciągu dwóch pokoleń w populacji roślin ryżu transformowanych przy użyciu nowego podwójnego systemu wektorów binarnych: pGreen/pSoup. pGreen jest małym wektorem binarnym Ti niezdolnym do replikacji w Agrobacterium bez obecności innego plazmidu binarnego, pSoup, w tym samym szczepie.
• Zaprojektowaliśmy zarówno pGreen, jak i pSoup, aby zawierały różne T-DNA. Doświadczenia transformacji przeprowadzono przy użyciu wektora pGreen zawierającego jednostki ekspresji bar i gusA (brak transgenu w pSoup) lub wektora pSoup zawierającego jednostki ekspresji aphIV i gfp (brak transgenu w pGreen ).
• Wysokie częstotliwości transformacji roślin (do 40%) uzyskano stosując geny oporności na herbicydy ( bar) lub antybiotykooporności ( aphIV). Około 80% niezależnie transformowanych roślin wyraża niewyselekcjonowane geny reporterowe (gusA lub gfp) obecne w wektorach. Transfer sekwencji szkieletowych był częsty (45% linii) i występował często w liniach wielokopiowych.
• Około 15-20% linii roślin ryżu zawierało pojedynczą integrację T-DNA bez szkieletu. Integracja dodatkowych kopii transgenu nie poprawiła poziomów ekspresji ani w roślinach T(0), ani w potomstwie T(1). Prawie wszystkie linie wielokopiowe zawierały transgeny zintegrowane w kilku loci w genomie rośliny, co pokazuje, że T-DNA z pGreen lub pSoup często integruje się w niepołączonych loci.
• Precyzyjne określenie liczby loci wymagało analizy obecności transgenów w potomstwie. Segregacja fenotypu transgenu była ogólnie myląca i miała tendencję do niedoceniania rzeczywistej liczby transgenicznych loci. Omówiono wkład tego nowego podwójnego, binarnego systemu wektorowego w rozwój wysokowydajnych systemów transformacji ryżu i produkcję transgenicznych roślin ryżu pozbawionych markerów.

Wektory binarne Ti są wektorami plazmidowymi z wyboru w protokołach transformacji roślin za pośrednictwem Agrobacterium.

Seria pGreen wektorów binarnych Ti została skonfigurowana pod kątem łatwości użycia i spełnienia wymagań szerokiego zakresu procedur transformacji dla wielu gatunków roślin. Ten system plazmidowy umożliwia dowolne rozmieszczenie markera selekcyjnego i genu reporterowego na prawej i lewej granicy T-DNA bez naruszania wyboru miejsc restrykcyjnych do klonowania, ponieważ miejsca klonowania pGreen oparte są na dobrze znanych ogólnych plazmidach wektorowych pBluescript.

Jego wielkość i liczba kopii w Escherichia coli zapewnia zwiększoną wydajność w rutynowych procedurach rekombinacji in vitro. pGreen może replikować się w Agrobacterium tylko wtedy, gdy w tym samym szczepie znajduje się inny plazmid, pSoup. pSoup zapewnia funkcje replikacji w trans dla pGreen. Usunięcie funkcji RepA i Mob umożliwiło ograniczenie rozmiaru pGreen do minimum.

Wersje pGreen zostały użyte do transformacji kilku gatunków roślin z taką samą wydajnością jak inne binarne wektory Ti. Informacje o systemie plazmidowym pGreen uzupełnia strona internetowa (http://www.pgreen.ac.uk), za pośrednictwem której można znaleźć wyczerpujące informacje, protokoły, formularze zamówień i wykazy różnych permutacji genów markerowych pGreen