Protokół immunocytochemii i barwienia immunofluorescencyjnego

Immunocytochemia
5x PB Buffer (= 250 mM bufor fosforanowy, pH 7,2 po rozcieńczeniu)
Aby zrobić 500 ml,
Wymieszać 140 ml 0,25 M NaH2P04
+ 360 ml 0,25 M NaH2P04
LUB
1x PB, 500 ml
35 ml 0,2 M NaH2P04
90 ml 0,2 M NaH2P04
375 ml wody
Do poniższych procedur wymagane jest 1x PB

20% Triton
– Odważyć 2g Tritonu na wadze przez pipetowanie do probówki,
– Uzupełnić do 10 ml wodą destylowaną
– Zaszalej w nocy

4% paraformaldehyd (mieszać w dymie)
Aby przygotować 50 ml,
– użyć ~ 40 ml wody do rozpuszczenia 2g paraformaidehydu
– dodać 200 uL 0,2 N NaOH i podgrzewać, mieszając w komorze dymowej
– po rozpuszczeniu + 10 ml buforu 5x PB
– zamrażać w porcjach ~ 10-15 ml w zamrażarce 20

Normalne serum kozie NGS
– przechowywać w porcjach w zamrażarce

Uwagi:
– jeśli po zamocowaniu ogniw pozostaw je mokre w lodówce, przykryte PB z prania
– zachować ostrożność podczas pipetowania i usuwania roztworów; w przeciwnym razie komórki odpadną

1. Umyć 1 x PB
2. Utrwal za pomocą 4% paraformaldehydu (10 min., 15-30 min. Jeśli komórki łatwo odpadają)
3. Przemyć 3x PB (po 5 min.)
4. Preinkubacja: na każdy 1 ml PB, + 1 00 uL NGS, 10 uL 20% Triton (15 min.)
5. Przeciwciało pierwotne: na każdy 1 ml całkowitej objętości dodać 20 ul NGS, 5 ul tritonu (2 godz.); rozcieńczenie pierwszorzędowych zależy od każdego przeciwciała i musi być testowane empirycznie lub zgodnie z zaleceniami producenta
6. Przemyć 3x PB (10 min. Każde)
7. Przeciwciało wtórne: wybierz właściwe (kozie przeciwciało przeciw mysie lub kozie przeciwciało przeciwkrólicze) CY3 (rozcieńczenie 1/800): na każdy 1 ml PB, 1,25 ul drugorzędowe, 5 ul tritonu, 25 ul NGS (30 minut do t iść zbyt długo, albo wysokie tło)
8. Przemyć 3x PB (po 15 min.)
9. Wyjąć mowial do rozmrożenia; wyjąć szkiełko nakrywkowe, osuszyć trochę kleeneksem, + 20uL mowial na komórki i przykryć nim szkiełko nakrywkowe
10. Odwróć szkiełko nakrywkowe na slajdzie
11. Umieść lakier do paznokci na czterech rogach szkiełka nakrywkowego. Gdy lakier wyschnie, nałóż lakier do paznokci na wszystkie szkiełka szkiełka nakrywkowego.
12. Możesz go obejrzeć lub ustawić w ciemności pod kątem czterech stopni. Szkiełka można przechowywać w ciemności pod kątem czterech stopni.

Leave a Reply

Your email address will not be published. Required fields are marked *