Protokół frakcjonowania komórek

Rozwiązania, które tego dnia będą świeże:
10 mM Tris, 2 mM EDTA, pH 7,5
W przypadku 25 ml użyj (a) 250 ul 1 M Tris + (b) 500 ul 0,1 M EDTA

Bufor cukrowy z 20 mM Tris, 0,5 M EDTA i 0,1 M NaCl
W przypadku 2 ml użyj (a) 40 uL 1 M Tris + (b) 10 uL 0,1 M EDTA + (c) 200 uL 1 M NaCl +
(d) 1,2 g sacharozy + (e) 1,75 ml wody

Uzupełnij również 20 ml buforu cukrowego bez cukru (do rozcieńczenia frakcji błony)
(a) 400 uL 1 M Tris + (b) 100 uL 0,1 M EDTA + (c) 2 ml 1 M NaCl + (d) 17,5 ml wody

Zrobić 1 ml powyższego buforu bez EDTA (do ponownego naprężenia podczas ostatniego kroku)
(a) 20 ul 1M Tris, 100 ul 1M NaCl

1 mM DTT
Najpierw zrób 0,1 M DTT (15,4 mg DTT w 1 ml wody), następnie weź 100 uL tego i dodaj do 10 ml 10 mM Tris, 2 mM EDTA (= 100 uL 1 M Tris, 200 uL 0,1 M EDTA)

40mM NEM w 20mM Tris
W przypadku 5 ml zważ 25 mg NEM + 100 ul 1M Tris

Inhibitory:
Inhibitory proteazy (pefabloc)
wykonane przy 400 mM lub 9,58 mg w 100 ul wody
stosować w końcowym stężeniu 1%
LUB
przy stosowaniu kompletnych inhibitorów (Roche)
rozpuścić 1 tabletkę w 2mL wody
porcjować i zamrozić
stosować w stężeniu końcowym 4% (tj. 4uL na 100ul próbki)

1. Pobierz media
2. przemyć 1x 10 ml PBS dla każdej płytki
3. Dodać 1 mL PBS i zeskrobać komórki skrobaczką do probówek Eppendorf; dodaj więcej PBS i zeskrob ponownie, jeśli nadal masz więcej komórek. Myj skrobak między różnymi typami próbek.
4. Wirować, aby osadzić komórki przez 1 min.

Opcjonalne kroki:
(a) Lyse w 10 mM Tris, 2 mM EDTA, 1 mM DTT
(b) Przemyć 2x powyższym roztworem, a następnie ponownie zawiesić w 200 ul powyższego roztworu
(c) Dodać 1: 1 z 40 mM NEM, 20 mM Tris i inkubować na lodzie przez 20 min.

5. Przemyć 2x 10 mM Tris, 2 mM EDTA
6. Zawieś ponownie w 400 μl powyższego buforu + 4 μl inhibitorów proteazy
7. Trzymaj na lodzie przez 1 godzinę; worteksować i homogenizować co 15 min
(W tym czasie umieść probówki i uchwyty wirówkowe na lodzie; włącz wirówkę Beckmana i ustaw ją na 38000 x g na 30 minut, 4 stopnie Celsjusza)
8. Przełóż 6x igłę 26,75 g (uważaj, aby nie uzyskać zbyt wielu pęcherzyków)
9. Umieść 500 μl 60% cukru, a następnie umieść próbkę na wierzchu w probówkach wirówkowych
Aby również otrzymać frakcję cytozolową, przed nałożeniem próbki umieść 10% roztwór sacharozy na wierzchu 60% sacharozy; po odwirowaniu frakcja cytozolowa będzie supernatantem na górze
10. Zrównoważyć rury
11. Wirowanie przy 38 000 x g, 30 min. w odchylanym wirniku
12. Wyjmij frakcję membrany znajdującą się pomiędzy górną frakcją (-ami) a 60% warstwą sacharozy (wyjmij około 300-400uL). Uważaj, aby nie wyjąć sacharozy.
13. Usunąć resztę płynu i ponownie zawiesić osad w odpowiednim buforze. Ten osad będzie frakcją jądrową.
14. Rozcieńczyć frakcję membrany co najmniej 6x w buforze sacharozowym bez sacharozy.
15. Wirować z prędkością 100 000 x g przez 15 minut
16. Zawieś ponownie w dowolnej wymaganej objętości 20 mM Tris, 0,1 M NaCl z + 1% 400 mM pefabloc
17. Aby przechowywać membranę frakcji białek błony, można dodać + 5% gliceryny i umieścić ją w zamrażarce -80, ale po ponownym wyjęciu należy ponownie zawiesić membrany w buforze myjącym (tj. Bufor cukrowy bez cukru ), a następnie ponownie obróć membrany z prędkością 100 000 xg

Leave a Reply

Your email address will not be published. Required fields are marked *