1. uruchom wektor i wstaw na żelu agarozowym wraz z drabinką DNA
2. obliczyć ilość obecnego wektora i wstawić:
na 6 ul rozcieńczonej 1/16 x drabinki DNA, 375 ng DNA jest obecne na prążku 1650 (Gibco)
oszacuj ilość wektora i wstawki DNA względem prążka 1650
weź również pod uwagę, że DNA dwa razy dłuższe niż pasmo 1650 powinno być dwa razy jaśniejsze, jeśli DNA o podwójnej wielkości jest dwa razy większe niż pasmo 1650
3. użyć 200ng wektora; jeśli wektor ma 10 kb, a insert ma 1 kb, dodaj 1/10 ilości insertu do reakcji ligacji
4. do jednej probówki ligacyjnej dodać 3x stężenie wkładki jak zwykle
5. zawierać probówkę kontrolną do ligacji bez wkładki
wstaw x uL
wektor y uL dla 200 ng DNA
Bufor do ligazy DNA T4 1 ul
Ligaza DNA T4 0,5 ul
woda do 10 ul
można zastosować większą objętość ligacji, jeśli wektor lub insert nie są wystarczająco skoncentrowane
inkubować w 14 lub 16 stopniach przez noc; temperatura pokojowa (22 stopnie) dwie godziny; 18 stopni 5 godzin; jeśli wykonujesz ligacje w temperaturze pokojowej, upewnij się, że temperatura w pomieszczeniu nie jest za niska ani za wysoka w zależności od pory roku
6. w razie potrzeby, dezaktywuj enzym w temperaturze 65 stopni przez 5-10 minut