Protokół proteomiki trawienia w żelu do pobierania odcisków palców mas peptydów i spektrometrii mas

0,1 M wodorowęglan amonu powinien być świeży dla każdego zestawu trawień (można go przechowywać przez jeden dzień w lodówce, bez konieczności filtrowania)

Mycie
1. Wlej trochę wody do probówek maksymalnego odzyskiwania.
2. Wycinaj fragmenty opaski barwionej Coomassie końcówką pipety P1000, uderzając w dół, a następnie ssąc pipetą.
3. Można powtórzyć dla kilku kawałków przed pipetowaniem ich do probówek maksymalnego odzyskiwania.
4. Umyj kawałki żelu, umieszczając 100 µl 0,1 M wodorowęglanu amonu i poddając je działaniu ultradźwięków przez 15 minut (bez potrzeby podgrzewania).
5. Zakręć ciecz.
6. Dodać równą objętość (100 ul) acetonitrylu i poddawać działaniu ultradźwięków przez kolejne 15 minut
7. Zakręć ciecz.
8. Usunąć cały płyn i w razie potrzeby powtórzyć etap mycia
9. Po każdym etapie mycia, przyłóż tubkę do kawałka białego papieru, aby sprawdzić, czy wszystkie kawałki żelu są białe
10. Jeśli są białe, nie trzeba już prać.
11. Dodaj acetonitryl i skurcz.

Redukcja i alkilacja
1. Dodać 50 ul 10 mM DTT w 0,1 M wodorowęglanie amonu w 56 stopniach C, 30 minut, wstrząsając.
2. Odkręć, usuń i dodaj acetonitryl, aby się skurczył.
3. Dodać 50 ul 55 mM jodoacetamidu w 0,1 M wodorowęglanie amonu i inkubować 20 minut w ciemności; rób to od czasu do czasu.
4. Zakręć w dół.
5. Przemyć 0,1 M wodorowęglanem amonu (150-200 ul). W razie potrzeby powtórz.
6. Zakręć w dół.
7. Obkurczać acetonitrylem.

Trawienie
1. Nawodnić w buforze do trawienia.
Skład buforu trawiącego: 50 ul wody, 50 ul 0,1 M wodorowęglanu amonu, 15 ul 0,1 ug / ul trypsyny wieprzowej, 5 ul 1% chlorku wapnia)
2. Zakręć i wyjmij po 30 minutach na lodzie.
3. Dodaj więcej buforu do trawienia bez trypsyny.
4. Inkubować przez noc w 37 stopniach z wytrząsaniem.

Ekstrakcja
1. Następnego dnia przenieś produkt mineralny do nowej probówki do odzyskiwania maksymalnego stężenia.
2. Dodać 20 µl 0,1 M wodorowęglanu amonu i poddawać działaniu ultradźwięków przez 15 minut
3. Zakręć w dół.
4. Dodać 40 μl acetonitrylu i poddawać działaniu ultradźwięków przez kolejne 15 minut.
5. Wyjmij i połącz w probówce do mineralizacji.
6. Dodaj 50 ul kwasu mrówkowego i sonikuj przez 15 minut.
7. Dodaj 100 ul acetonitrylu i sonifikuj przez kolejne 15 minut.
8. Połącz.
9. W razie potrzeby podzielić na dwie lub więcej probówek, zamrozić w ciekłym azocie, liofilizować i zamrozić w -20 stopniach C.

Leave a Reply

Your email address will not be published. Required fields are marked *